Експериментальне застосування та рішення для усунення несправностей для ультрафільтраційних відцентрових трубок

Ультрафільтраційна відцентрова трубка є широко використовуваним мембранним фільтраційним пристроєм у лабораторії. Його основним компонентом є ультрафільтраційна мембрана з обмеженням певної молекулярної маси. Загальні матеріали ультрафільтраційної мембрани включають поліефірсульфон (PES) і регенеровану целюлозу (RC). Принцип роботи ультрафільтраційної відцентрової трубки полягає у використанні відцентрової сили та молекулярного -розміру-просіювання для проходження малих молекул через ультрафільтраційну мембрану, що забезпечує швидке концентрування, знесолення, обмін буфера або очищення та розділення біомакромолекул, таких як білки та нуклеїнові кислоти.

 

Вибір MWCO

білок	Рекомендований MWCO	Рекомендований час центрифугування
6–20 кДа	3 кДа	40 хв
20–30 кДа	5 кДа	30 хв
30–60 кДа	10 кДа	20 хв
60–100 кДа	30 кДа	20 хв
100–200 кДа	50 кДа	15 хв
200–600 кДа	100 кДа	15 хв
>600 кДа	300 кДа	15 хв
Одноланцюгові- або дво-молекули нуклеїнової кислоти	Рекомендований MWCO	Рекомендований час центрифугування
137–1159 п.н	30 кДа / 100 кДа	10 хв (ротор-з фіксованим кутом, 5000 × g)
Нанокульки	Рекомендований MWCO	Рекомендований час центрифугування
1,5–2 нм	3 кДа	40 хв
2–3 нм	5 кДа	30 хв
3–5 нм	10 кДа	20 хв
5–7 нм	30 кДа	20 хв
7–10 нм	50 кДа	15 хв
10–30 нм	100 кДа	15 хв
>30 нм	300 кДа	15 хв

 

Для білків рекомендовано вибирати мембранний MWCO, який у 2–6 разів нижчий за молекулярну масу цільового білка. Якщо також враховується швидкість потоку, рекомендована мембрана MWCO нижче цього діапазону 2×–6×.

 

Випадок застосування (ДНК із виділених клітин)

Для традиційного методу шматок марлі розміром 2,5 см × 2 см відрізали, лізували в системі з невеликим-об’ємом і безпосередньо очищали за допомогою приладу. Для концентраційного методу площу відбору проб збільшували вдвічі. Після лізису супернатант розщеплення переносили в ультрафільтраційну центрифужну пробірку на 100 кДа, концентрували центрифугуванням при 10 000 об/хв, відновлювали інвертованим центрифугуванням, а потім піддавали екстракції ДНК за допомогою повністю автоматизованого приладу для очищення нуклеїнових кислот. Об’єм елюції рівномірно встановлювали на 40 мкл, щоб гарантувати, що початкові рівні клітин у двох групах були по суті порівнянними.

 

Кількісне тестування показало, що середня концентрація ДНК становила 0,099 ± 0,041 нг/мкл для звичайного методу та 0,193 ± 0,068 нг/мкл для концентраційного методу. Різниця між двома групами була статистично значущою (P <0,01). Загальний вихід ДНК, отриманий за допомогою методу концентрації, був у 1,95 рази більшим, ніж за звичайним методом, демонструючи, що стадія ультрафільтраційного концентрування майже не призвела до втрати загальної ДНК. Значення Ct для двох груп становили 27,64 ± 0,39 і 27,58 ± 0,40, відповідно, з P > 0,01, що вказує на те, що лікування ультрафільтрацією не вводило інгібіторів ПЛР-ампліфікації або не перешкоджало подальшим реакціям ампліфікації.

 

Для генотипування STR повний генотип визначався повними смугами в кожному локусі та середньою висотою піку, що перевищує або дорівнює 200 RFU. Серед 20 паралельних зразків звичайний метод дав повні генотипи лише для 14 зразків, тоді як метод концентрації досяг повного генотипування STR для всіх 20 зразків, значно підвищивши ефективну швидкість виявлення генотипу слідів контактних зразків.

Ультрафільтраційні відцентрові трубки Guidling Technology відрізняються простотою експлуатації, високими коефіцієнтами концентрації та високою швидкістю відновлення зразків і широко використовуються в біохімії, молекулярній біології та інших галузях. Швидкість відновлення ультрафільтраційних відцентрових труб Guidling Technology змінюється залежно від матеріалу, що обробляється, і зазвичай може перевищувати 90%.

 

Загальні усунення несправностей

проблема	Можлива причина	Рішення
Під час концентрації відбувається випадання осаду	Концентрація надто швидка	Зменшіть швидкість центрифугування
		Використовуйте ультрафільтраційну трубку з більш високою молекулярною масою
		Прокапайте вгору-вниз у відцентровій пробірці, потім знову відцентрифугуйте
	Над-концентрація	Рекомендується, щоб кінцева концентрація білка після концентрації не перевищувала 20 мг/мл
Воду не можна фільтрувати	Ультрафільтраційна мембрана повністю висихає, а поверхня мембрани стає слабо гідрофобною	Змочіть мембрану розчинником із низьким -поверхневим-натягом (наприклад, виконайте початкове центрифугування з 20% етанолом у воді)
Цільовий білок у концентраті відсутній	Початкова концентрація зразка білка занадто низька (< 25 μg/mL)	Якщо концентрація зразка низька, а об’єм великий, повторно завантажте зразок і центрифугуйте
	Неправильний вибір мембрани MWCO	MWCO мембрани, як правило, менше ніж у 2 рази перевищує молекулярну масу цільового білка або більше
	Відцентрова сила знаходиться поза вказаним діапазоном	Рекомендована відцентрова сила: 3000–5000 × g
	Цільовий білок випав в осад	Відрегулюйте цільову концентрацію білка в концентраті (відрегулюйте коефіцієнт концентрації)
		Контролюйте температуру і pH
		Використовуйте добавки
		Відрегулюйте іонну силу
Перешкоди виникають під час подальшого аналізу концентрованого білка	Ультрафільтраційна мембрана містить слідові кількості гліцерину	Попередньо-промийте ультрафільтраційну трубку буфером і очищеною водою. Якщо перешкоди не зникають, очистіть 0,1 М NaOH, потім промийте очищеною водою та висушіть
Зараження РНКазою	Немає гарантії, що трубка для ультрафільтрації не містить-РНКази	Рекомендується замочувати в 0,1% DEPC при 37 градусах протягом 2 годин, щоб повністю інактивувати РНКазу; залишковий DEPC можна видалити шляхом промивання очищеною водою
Зараження ендотоксинами	Ультрафільтраційні трубки, що постачаються, не пройшли процедуру видалення-ендотоксинів, а ендотоксини широко присутні в природі	Перед експериментом попередньо -очистіть 0,5 М NaOH, а потім промийте очищеною водою, щоб видалити більшість ендотоксинів