Фільтрація тангенціального потоку TFF у поєднанні з ультрацентрифугуванням для ефективного приготування малих позаклітинних везикул

Малі позаклітинні везикули (sEV) — це нанорозмірні везикули, що виділяються клітинами, які містять нуклеїнові кислоти, білки, малі молекули та інші компоненти та відіграють важливу роль у міжклітинному спілкуванні. Малі позаклітинні везикули-типу екзосом мають велику схожість зі своїми батьківськими клітинами. У порівнянні зі штучними наночастинками вони демонструють нижчі показники імунного очищення та нижчу цитотоксичність, що робить їх перспективними кандидатами як новізасоби доставки ліків in vivo. Майже всі типи клітин можуть секретувати ці везикули, і дослідження щодо їх застосування як носіїв ліків поступово переходять від лабораторії до клінічних застосувань. однак,велико{0}}виробництво залишається головним вузьким місцем.

 

Сучасні методи виділення позаклітинних везикул

Сучасні методи ізоляції позаклітинних везикул включаютьультрацентрифугування, центрифугування в градієнті густини, ексклюзійна хроматографія (SEC) і осадження поліетиленгліколем (PEG).

Осадження ПЕГ забезпечує високий вихід і просту роботу, але воно пов’язане зі значним забрудненням небажаними білками. Центрифугування в градієнті густини та ексклюзійна хроматографія-можуть отримати продукти високої-чистоти, але їхня ефективність відносно низька, а процеси вимагають-часу. Ультрацентрифугування широко використовується, але його обсяг обробки обмежений потужністю центрифуги, що ускладнює масштабування.

 

Застосування тангенціальної фільтрації потоку для розділення sEV

Фільтрація тангенціального потоку (TFF) вже застосовувалася для розділення наночастинок, таких як ліпосоми та лентивірусні вектори. У TFF подача тече тангенціально по поверхні мембрани, що допомагає зменшити забруднення мембрани та полегшує масштабування процесу.

Оскільки малі позаклітинні везикули зазвичай коливаються від30–200 нмв діаметрі, аМембранна касета 0,45 мкмможна вибрати в системі TFF для видалення більших білків і везикул, тоді як aМембранна касета 300 кДаможна використовувати для видалення маломолекулярних-білків і концентрації малих позаклітинних везикул, присутніх у культуральному середовищі.

 

Характеристика сировини після сепарації TFF

Аналіз відстеження наночастинок (NTA) показав, що діаметри частинок були в основному розподілені в діапазоні0–250 нм.

 

 

Однак трансмісійна електронна мікроскопія (ТЕМ) виявила велику кількість забруднюючого білка, тоді як позаклітинних везикул не спостерігалося. Ці результати показали, що для подальшого очищення позаклітинних везикул необхідний додатковий етап очищення.

 

Характеристика концентрату TFF після ультрафільтрації 100 кДа

Концентрат TFF був додатково оброблений за допомогою aУльтрафільтраційна трубка 100 кДа.

NTA показав, що діаметри частинок у концентратах, отриманих після одного та двох раундів ультрафільтрації, залишалися в основному в діапазоні0–250 нм. Однак виконання ультрафільтрації двічі призвело до значного зменшення кількості отриманих частинок.

ТЕМ-аналіз показав, що жодних везикулоподібних-структур не спостерігалося ні в-, ні в-концентратах ультрафільтрації-одноразової ультрафільтрації, тоді як залишалася значна кількість забруднюючого білка.

томуУльтрафільтрація 100 кДа не може бути ефективно використана для очищення культурального середовища після концентрації TFF.

 

 

Характеристика концентрату TFF, очищеного ультрацентрифугуванням

NTA показало, що діаметри частинок очищених продуктів були в основному розподілені в межах діапазону0–250 нм.

Важливо, що ТЕМ чітко виявив везикулоподібні-структури в різних полях зору. Ці результати продемонстрували, що після концентрування культурального середовища за допомогою TFF,Ультрацентрифугування можна згодом використовувати для подальшого відділення та очищення позаклітинних везикул.

 

 

Характеристика sEVs, виділених із середовища, кондиціонованого мезенхімальними стовбуровими клітинами, за допомогою TFF у поєднанні з ультрацентрифугуванням

NTA показало, що діаметри частинок очищених продуктів були в основному розподілені в межах діапазону0–250 нм.

Везикулоподібні-структури були виявлені за допомогою ПЕМ. Вестерн-блоттинг продемонстрував позитивну експресію протеїнів, пов’язаних із позаклітинними везикулами-CD9, CD63 і ALIXв очищених позаклітинних везикулах.

Ці результати підтвердили, що очищені маленькі позаклітинні везикули містили екзосоми, що вказує на те, що цей метод також можна використовувати длявиділення та екстракція екзосом.

 

 

Висновок: TFF у поєднанні з ультрацентрифугуванням для високо-якісного приготування sEV

Дослідження це показалолише концентрація TFFпризвело до отримання продукту, що містить значну кількість забруднюючих білків, і тому було недостатньо для отримання кваліфікованих позаклітинних везикул.

Так само, використовуючи aУльтрафільтраційна трубка 100 кДа для вторинного очищенняне дає ефективно інтактних структур везикул.

Поєднуючи концентрацію TFF з подальшим очищенням ультрацентрифугуванням, можна об’єднати переваги обох методів для отриманнявисокоякісні-продукти малих позаклітинних везикул.

У порівнянні зі звичайним ультрацентрифугуванням поодинці комбінований процес може бути ефективнимзменшити загальний час обробки та підвищити ефективність розділення.

У цьому робочому процесіTFF дозволяє швидко збагачувати-великі зразки, розглядаючи обмеження звичайного ультрацентрифугування при обробці великих об’ємів зразків. Потім ультрацентрифугування виконує глибоке очищення для видалення со-концентрованих білкових домішок, допомагаючи підтримувати чистоту та цілісність везикул.

Крім того, процес не вимагає додаванняекзогенні хімічні реагенти для осадження, сприяючи максимальному збереженню біологічної активності везикул.

З точки зору промислового перекладу, цей процес має важливе значеннязбільшити-потенціалі може допомогти вирішити проблеми, пов’язані з-великомасштабним виробництвом позаклітинних везикул длядоставка ліків, регенеративна медицина та розробка відповідних продуктів. Це також забезпечує надійну експериментальну основу для подальшої оптимізації процесу та пілотного-виробництва.

 

довідка

Ван Лінг, Лі Менші, Сюй Ша та ін.Розробка методу розділення малих позаклітинних везикул методом тангенціальної фільтрації в поєднанні з ультрацентрифугуванням. Китайський біологічний журнал, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.